线粒体是细胞生命活动的重要组成部分,素有“动力工厂”之称,是能量代谢的主要场所,同时也是对各种损伤最为敏感的细胞器之一。线粒体的结构损伤主要表现为肿胀、膜损伤和嵴断裂;功能损伤主要表现为MPTP开放，引起丧失及CytC和AIF释放等，同时产生ROS，最终导致细胞凋亡。而MPTP的流式分析是大家在做该实验最难的环节。下面我们来介绍一下流式细胞术检测MPTP的开放情况。

试剂盒原理：

首先通过被动运输加载Calcein AM，后者是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，能够轻易穿透活细胞膜，被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内，使胞质包括线粒体发出强绿色荧光。加入CoCl2后，来自胞浆的荧光被CoCl2淬灭，仅留下线粒体内的荧光。作为对照，可将细胞加载Calcein AM和CoCl2 的同时，对其用Ionomycin处理，从而使细胞加载更多的Ca2+，引起线粒体通透性转换孔的激活从而使线粒体荧光淬灭。

1.样品制备：

将染色和处理后的细胞重悬于适当体积的Assay Buffer中。

2.流式细胞仪设置：

设置流式细胞仪进行FITC通道检测钙黄绿素荧光。

3.数据采集：

设定适当的门控策略，选择单细胞群体进行数据采集。

收集每个样品至少10,000个事件（密度10⁶/mL）以确保结果的统计可靠性。

4.分析结果：

通过分析荧光强度的变化，判断线粒体膜通透性转换孔的开放状态。

对照实验：设置阴性和阳性对照。阴性对照为未处理细胞，阳性对照为处理后加入MPTP诱导剂的细胞（如Ca2+离子）。

注意事项

1.实验条件的标准化：

确保培养条件、染色时间和温度的标准化，以保证实验的可重复性。注意整个过程均需避光操作。染色后,将样品置于冰上,可以在1小时内进行流式细胞仪检测和分析。

2.染色和处理条件的优化：

根据细胞类型不同，可能需要优化钙黄绿素AM和CoCl2的浓度和孵育时间。

3.流式细胞仪的校准：

在每次实验前，确保流式细胞仪的校准，以获得准确的荧光信号。注意使用仅含检测缓冲液的并且未经染色的细胞样品用于流式细胞仪的阴性对照设置。Calcein的最大激发光波长为494nm,最大发射光波长为517nm。

通过上述步骤，可以利用钙黄绿素流式细胞分析方法有效检测和分析线粒体通透性转换孔的开放状态，从而研究线粒体功能和细胞凋亡过程。

图片来自网络

FLOWJO分析结果显示,正常细胞MFI值为:1703,损伤细胞MFI值为:339。损伤细胞荧光强度明显低于正常细胞。

在做流式之前，为了确保实验操作的准确性，可以在荧光显微镜下观察细胞悬液的荧光状态。

图5. Calcein AM (1X)与L929细胞进行孵育，细胞质包括线粒体发出强绿色荧光(A)；细胞与CoCl2 (1mM)孵育以后，细胞质内Calcein的绿色荧光被CoCl2淬灭，仅留下线粒体内的绿色荧光(B)；使用Ionomycin (0.25μM)处理细胞，诱导细胞外的Ca2+大量进入细胞内，过多的Ca2+进入线粒体基质，导致MPTP的开放，使部分Calcein从线粒体内释放，同时使钴离子进入线粒体内并导致Calcein的绿色荧光淬灭(C)。

为了帮助小伙伴们进行正确操作，我们研发老师亲自操作拍摄视频，供大家学习与参考。在此处导入KTA4002的操作视频。

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